高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱,对供试品
进行分离测定的色谱方法。
注入的物质,由流动相带入色谱柱内,组分在柱内分离,并进入检测器检测,由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1. 对仪器的一般要求和色谱条件
高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据处理系统等组成。
(1)色谱柱
反相色谱柱:以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、
聚合物复合硅胶和聚合物等;常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和
苯基键合硅胶等。
正相色谱柱:用硅胶填充剂,或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常见的填充剂
有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。
离子交换色谱柱:用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。分为阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性拆分色谱柱:用手性填充剂填充而成的色谱柱。
色谱柱的内径与长度、填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表
面覆盖度、载体表面基团残留量、填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能,应根据被
分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
常用的色谱柱内径一般为 3.9~4.6 mm,填充剂粒径为 3~10 um。
温度会影响分离效果,相应资料中未指明色谱柱温度时系指室温,应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度,一般不宜超过 60℃。
残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱,流动相 pH值一般应在 2~8之间。当流动相 pH值大于 8 时,硅胶易溶解;pH 值小于 2 时,化学键合基团易水解。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛 pH 值的流动相,适合于pH 值小于 2 或大于8的流动相。
(2)检测器
最常用的检测器为紫外-可见分光检测器,包括二极管阵列检测器。其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。
紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器,其响应值不仅与
被测物质的量有关,还与其结构有关;蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用型检测器,
对所有物质均有响应,结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量
有关。
紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测
物质的量在一定范围内呈线性关系,但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指
数关系,一般需经对数转换。
不同的检测器,对流动相的要求不同。紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫外-可
见分光光度法对溶剂的要求;采用低波长检测时,还应考虑有机溶剂的截止使用波长,并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。
(3)流动相
反相色谱系统的流动相常用甲醇-水系统和乙腈-水系统,用紫外末端波长检测时,宜选用乙腈-水系统。流动相中应尽可能减少缓冲盐的用量,如需用时,应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时,流动相中有机溶剂应不低于5%,否则十八烷基链的随机卷曲将导致柱效下降、色谱系统不稳定。
正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂,如二氯甲烷-正己烷等。
相应资料中规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外,其余如色谱柱内径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等,均可适当改变,以达到分析目的的要求。调整流动相组分比例时,当小比例组分的百分比例 X小于等于 33% 时,允许改变范围为 0.7X~1.3X;当X大于 33% 时,允许改变范围为 X-10~X+10。
当必须使用特定牌号的色谱柱方能满足分离要求时,相应资料中应特别注明。
2. 系统适用性试验
在某些特定要求中,需进行系统适用性试验。色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、灵敏度、拖尾因子和重复性等五个参数。按相应资料中要求对色谱系统进行适用性试验,即用规定的对照品溶液或系统适用性试验溶液对规定的色谱系统进行试验。必要时可对色谱系统进行适当调整,以符合分析要求。
(1)色谱柱的理论板数(n)
用于评价色谱柱的分离效能。由于不同物质在同一色谱柱上的色谱行为不同,采用理论板数作为衡量色谱柱效能的指标时,应指明测定物质,一般为待测物质或内标物质的理论板数。
在规定的色谱条件下,注入供试品溶液或相应资料中规定的物质溶液,记录色谱图,量出供试品主成分色谱峰或规定物质色谱峰的保留时间 tR和峰宽(W)或半高峰宽(Wh/2),按 n=16(tR/W)2或 n=5.54(tR/Wh/2)2计算色谱柱的理论板数。tR、W、Wh/2可用时间或长度计(下同),但应取相同单位。
(2)分离度(R)
用于评价待测物质与被分离物质之间的分离程度,是衡量色谱系统分离效能的关键指标。可以通过测定待测物质与已知杂质的分离度,也可以通过测定待测物质与某一指标性成分(内标物质或其他难分离物质)的分离度,或将供试品(对照品)用适当的方法降解,通过测定待测物质与某一降解产物的分离度,对色谱系统分离效能进行评价与调整。
无论是定性鉴别还是定量测定,均要求待测物质色谱峰与内标物质色谱峰或特定的杂质
对照色谱峰及其他色谱峰之间有较好的分离度。除另有规定外,待测物质色谱峰与相邻色谱
峰之间的分离度应大于 1.5。分离度的计算公式为:
2×(tR1-tR2) 2×(tR1-tR2)
R=--------------------- 或 R=-----------------------------
W1+W2 1.70×(W1h/2+W2h/2)
式中,tR2 为相邻两色谱峰中后一峰的保留时间;tR1为相邻两色谱峰中前一峰的保留时间;
W1、W2及W1,h/2、W2,h/2分别为此相邻两色谱峰的峰宽及半高峰宽。当对测定结果有异议时,色谱柱的理论板数(n)和分离度(R)均以峰宽(W)的计算结果为准。
(3)灵敏度
用于评价色谱系统检测微量物质的能力,通常以信噪比(S/N)来表示。通过测定一系列不同浓度的供试品或对照品溶液来测定信噪比。定量测定时,信噪比一般应不小于5;定性测定时,信噪比一般应不小于3。系统适用性试验可以设置仪器不同的灵敏度或测试不同浓度对照品溶液来评价色谱系统的检测能力。
(4)拖尾因子(T)
用于评价色谱峰的对称性。拖尾因子计算公式为:
T = W0.05h/2d1
式中:W0.05h为 5%峰高处的峰宽;
d1为峰顶在5%峰高处横坐标平行线的投影点至峰前沿与此平行线交点的距离。
以峰高作定量参数时,除另有规定外,T 值应在 0.95~1.05 之间。
以峰面积作定量参数时,一般的峰拖尾或前伸不会影响峰面积的积分,但严重拖尾会影响基线和色谱峰起止的判断对峰面积积分的准确性,此时相应资料中应对拖尾因子作出具体的规定。
(5)重复性
用于评价色谱系统连续进样时响应值的重复性能。采用外标法时,通常取对照品溶液,连续进样5次,除另有规定外,其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于 3.0%;采用内标法时,通常配制相当于 80%、100%和 120%的对照品溶液,加入规定量的内标溶液,配成 3种不同浓度的溶液,分别至少进样2次,计算平均校正因子,其相对标准偏差应不大于 3.0%。
3. 测定法
(1)内标法
按相应资料中的规定,精密称(量)取对照品和内标物质,分别配成溶液,各精密量取适量,混合配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量进样,记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高,按下式计算校正因子:
AS/CS
校正因子(f)=------------
AR/CR
式中,AS为内标物质的峰面积或峰高;AR为对照品的峰面积或峰高;CS为内标物质的浓度;CR为对照品的浓度。
再取各含有内标物质的供试品溶液,进样,记录色谱图,测量供试品中待测成分和内标物质的峰面积或峰高,按下式计算含量:
AX
含量( CX)= f ×-------------
A’s/C’s
式中,AX为供试品的峰面积或峰高;CX为供试品的浓度;A'S为内标物质的峰面积或峰高;C'S为内标物质的浓度;f为校正因子。
采用内标法,可避免进样体积误差对测定结果的影响。
(2)外标法
按相应资料中的规定,精密称(量)取对照品和供试品,配制成溶液,分别精密取一定量,进样,记录色谱图,测量对照品溶液和供试品溶液中待测物质的峰面积(或峰高),按下式计算含量:
含量(CX) = CR×AX/AR
式中各符号意义同上。
由于微量注射器不易精确控制进样量,当采用外标法测定时,以手动进样器定量环或自
动进样器进样为宜。
(3)加相对响应因子的主成分自身对照法
测定杂质含量时,可采用加相对响应因子的主成分自身对照法。
精密称(量)取杂质对照品和主成分对照品各适量,配制成不同浓度的相对响应因子测定溶液,进样,记录色谱图,分别绘制杂质浓度和主成分浓度对其峰面积的回归曲线,以杂质回归直线斜率与主成分回归直线斜率的比计算相对响应因子。当相对响应因子在 0.9~1.1之间时,可采用不加相对响应因子的主成分自身对照法测定。
测定杂质含量时,按规定的杂质限度,将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液作为对照溶液,进样,调节检测器灵敏度(以噪声水平可接受为限)使对照溶液的主成分色谱峰的峰高约达满量程的10%~25% 或其峰面积能准确积分。通常含量低于 0.5%的杂质,峰面积的相对标准偏差(RSD)应小于 10%;含量在 0.5%~2%的杂质,峰面积的 RSD 应小于 5%;含量大于 2%的杂质,峰面积的 RSD应小于 3%。然后,取供试品溶液和对照溶液适量,分别进样。除另有规定外,供试品溶液的记录时间应为主成分色谱峰保留时间的 2倍。测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积,分别乘以相应的相对响应因子后与对照溶液主成分的峰面积比较,计算各杂质含量。
(4)不加相对响应因子的主成分自身对照法
测定杂质含量时,若没有杂质对照品,或相对响应因子可以忽略,可采用不加校正因子的主成分自身对照法。
同上述(3)法配制对照溶液并调节检测器灵敏度后,取供试品溶液和对照溶液适量,分别进样。除另有规定外,供试品溶液的记录时间应为主成分色谱峰保留时间的2 倍,测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比较,计算杂质含量。
(5)面积归一化法
按相应资料中的规定,配制供试品溶液,取一定量进样,记录色谱图。测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积,计算各峰面积占总峰面积的百分率。用于杂质检查时,由于峰面积归一化法测定误差大,因此,通常只用于粗略考查供试品中的杂质含量。除另有规定外,一般不宜用于微量杂质的检查。